文献分享同位素稀释串联质谱法在先天性
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同位素稀释串联质谱法在先天性肾上腺增生诊断中的应用
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纲
前言
研究过程
讨论总结
名词解释
先天性肾上腺增生症（CAH）是常染色体隐性遗传病，是由肾上腺类固醇合成途径的酶缺陷引起的。CAH的共同特征包括男性化、生殖器模糊等。如果CAH未被识别和治疗，女孩和男孩出生后都会出现快速生长和性早熟的情况。
干血斑(DBS,DriedBloodSpot)是一种血样采集方法，有别于传统抽血的方法,DBS只需把血样滴到滤纸上就能完成采集,从采集样品到样品萃取及分析都带来很大的优势。
01
前言
17-OHP是新生儿筛查和诊断CAH的首选检测目标，因为它能检测最常见的CAH形式（90%的病例）。目前液相色谱串联质谱LC-MS/MS能高灵敏度和高特异性测定不同类固醇，价格也相对较低。质谱分析可以同时检测皮质醇、DHEA、脱氧皮质醇、17-OHP、雄烯二酮和孕烯醇酮，减少了从患者取得的血液，还可降低假阳性。但是，LC-MS/MS的临床应用也存在一些问题，包括复杂的前处理以及某些被测物所需要的衍生化处理。
新生儿是CAH检测的主要患者群体，考虑到该人群的血容量有限，获取血液样本困难，DBS（而不是血清或血浆）是理想的样本。目前DBS已广泛成功地应用于新生儿筛查、治疗药物监测、分子生物学和毒理学检测等领域。
02
研究过程
7种类固醇MRM图谱
图1是使用DBS检测的所有7种类固醇，色谱分离7.3分钟即可完成。大部分均可使用色谱进行分离，其中17-OHP（2.9min）和DHEA（2.95min）无法通过色谱进行分离，因此需要在MRM模式下选择特征离子进行区分。
图1用本文方法分析了7种类固醇的MRM图谱
时间因素的影响
作者用模拟DBS研究了类固醇达到最大提取所需的时间。将DBS置于提取溶剂（95%甲醇水溶液）中进行不同时间[0、2.5、5、10、15min]进行提取。所有5种类固醇激素在2.5min时均有最高的响应（AUC），在此时间点后无变化（图2）。作者决定将提取时间定为5分钟，以确保所有类固醇均从DBS中提取。且发现所有的残留效应在可接受范围内，DHEA和孕烯醇酮的定量限较为狭窄，相对的最低定量限也较高。并对来自CDC新生儿筛查项目认证的质控样本进行分析。
图2时间对DBS中类固醇提取的影响
能力验证
由于很难找到阳性患者进行方法相关性分析，于是对其进行了能力验证。标本为不同浓度、不同比例类固醇的干血斑，被用作许多新生儿筛查项目的能力验证。样本取自美国疾病控制与预防中心新生儿筛查质量保证计划（NSQAP）的能力验证样本。在图3中，该方法与美国疾病控制与预防中心报告CDC的数值进行了比较。皮质醇和17-OHP呈正比例偏差。Bland-Altman图显示，雄烯二酮、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇的偏差小于10%（图3B）。然而，对于大于ng/mL的浓度，17-OHP的偏置小于20%。皮质醇对低于50ng/mL的浓度显示小于20%的偏差。
图3A，B两图均为BlandAltman分析
作者计算了从CDCNSQAP收到的所有样本的CAH临床比值，如图3A所示。NSQAP准备的样本包括CAH的不同临床病例，包括假阳性、假阴性、真阳性等。计算出的临床比率与所有样本匹配，因此可以正确地识别指示CAH的类固醇数据样本以及正确地识别阴性样本。作者采用所建立的方法对82例确定的临床样本进行分析，并计算临床比值（临床比值=(17-OHP+21-脱氧皮质醇)/皮质醇）。所有样本的临床比值均小于1，表明患者没有CAH。有几个样本的皮质醇水平很低，这是诊断CAH的标准，然而使用临床比率的方法却表明他们没有CAH。
03
讨论总结
在该研究中，作者开发了一种从DBS中用液相色谱串联质谱法同时测量7种类固醇的方法，用于实验室诊断先天性肾上腺增生CAH。在本研究中，所有类固醇及其内标均采用电喷雾正电离模式进行检测，以获得每个化合物的最高信号。由于脱氢表雄酮和孕烯醇酮在血清中的浓度很低且离子化较差，因此需要衍生化进行LC-MS/MS检测。作者通过使用高灵敏度质谱分析样品而不进行衍生化，克服了这个问题。
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编辑
徐增益、冯汕城审核
喻静兰
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